尽管AAV基因治疗药物已显示出巨大的前景，但是AAV的工业化生产和供应链仍是行业发展的主要痛点之一。其中AAV载体纯化工艺的种种问题，如空衣壳的去除等，都使得AAV的生产成本与复杂程度大幅度增加。本文将简要讨论AAV生产工艺下游纯化工艺的挑战。

AAV病毒载体的生产流程分为上游病毒包装和下游病毒纯化。上游目的是完成AAV在细胞中的包装生产，下游目的是将上游加工生产的病毒载体从各种杂质中分离出来，使得最终产品符合质量标准的要求，并能应用于临床。下游的纯化工艺除了提供高纯度产品，还需要具有可放大性，可用于大规模生产，能满足较大规模临床试验以及后期商业化的需要。

图一：AAV的生产流程概述（源自DOI:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.03.016）

AAV生产过程中产生的杂质大致有两类。一类源于生产工艺中的原材料和组分，包括细胞底物、细胞培养基以及辅助组分（如病毒和质粒DNA）等，如表一所示。另一类与AAV产品自身性质有关的杂质，如空衣壳，后面将详细介绍。

宿主细胞DNA残留的担忧是基于致癌风险理论，特别是生产细胞系所包含的致癌序列，比如最常见腺病毒基因E1A和E1B（HEK293, PerC.6 和CAP 细胞系），人乳头瘤病毒E6和E7基因（HeLa细胞系)等。当使用致癌细胞系生产AAV时，下游纯化须尽可能减少残留DNA。工业上一般使用核酸酶分解残留DNA，普遍认为小于200 bp的DNA片段可显著降低致癌风险。

宿主细胞蛋白残留与免疫原性、炎症或过敏性休克有关。尽管与非人类的生产原料相比（非人类细胞系如BHK21或昆虫细胞，以及辅助病毒如HSV、腺病毒、杆状病毒），人类细胞免疫原性比较弱。但是考虑到AAV较大的治疗剂量，宿主细胞蛋白以及病毒蛋白相关的风险就不容忽视，因此在下游生产过程中必须尽可能减少蛋白残留。

另外在上游过程中可能会引入其他杂质，比如培养基所含的胎牛血清（BSA）、分解DNA的核酸酶、破坏细胞的洗涤剂，以及可能使用的辅助病毒（如HSV、腺病毒或杆状病毒)等，因此对上游的生产原料须加以控制，尽可能避免有毒性的原料。

产品相关性杂质是指在生产或存储过程中形成产品的分子变体，包括生物合成过程的中间产物、包装内容物不正确的病毒颗粒（空衣壳/部分衣壳，包装残留质粒或宿主细胞 DNA 的类 AAV 病毒颗粒），以及降解的、氧化或是聚集的载体。这类杂质并无治疗效果，而且存在安全隐患。表2列出了与AAV载体产品相关杂质，包括表征方法及其潜在毒性。

表二：与AAV载体产品相关的杂质

（源自：https://doi:10.3390/biomedicines2010080）

目前三种AAV载体的生产体系（三质粒瞬转体系、杆状病毒表达载体体系以及包装细胞体系） 中都会出现三种衣壳：完整衣壳（full capsid）、部分衣壳（partial capsid），和空衣壳（empty capsid）。其中完整衣壳包含正确的DNA序列，是人们所期待的产品；部分衣壳和空衣壳包含部分不包含目的基因，属于生产中的杂质，约占细胞生产的总AAV颗粒的50%-90%。

空衣壳/部分衣壳有如下几种危害：1), 影响产品的纯度，2), 增加最终产品的免疫原性，3), 与完整衣壳竞争感染细胞上的载体结合受体，抑制完整衣壳的转导，4),增加总体病毒载量。部分衣壳与空衣壳地存在严重地影响了AAV产品的安全性和有效性，因此监管机构强烈建议在整个生产过程中监控空/完整衣壳比（空壳率）。

图二 ：AAV制备过程中所产生的病毒颗粒类型

（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010）

在AAV载体制备中减少空衣壳一般两种方法：一是优化上游载体生成条件，提高包装效率，减少空衣壳的比例；二是优化下游纯化工艺，有效地去除空衣壳。

氯化铯(CsCl)/碘克沙醇密度梯度离心大概是最古老的最传统的AAV纯化技术了。这种技术适用于所有血清型且分辨率高，但是因生产工艺很难放大，低通量等缺点阻碍了其在工业中的应用。继密度梯度离心之后，色谱法不断发展，并逐渐成为一种成熟的、主流的方法。色谱法通过载体的净电荷、疏水性、对配体的亲和性、大小以及其他性质来分离并纯化载体。这类技术有诸多的优点：更具可扩展性和成本效益，可多次重复使用，可并行运行或串联运行，还可有效去除非定植剂，这是开发后期的一个关键方面。本文重点介绍色谱法中的亲和层析以及离子交换层析。

图三：亲和层析AAV的纯化，通过AAV与填料的基质上偶联的抗体或纳米体地特异性结合来实现

（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001)

• 最早一代的亲和层析是肝素亲和层析（Heparin affinity chromatography）。缺点在于结合背景高、动物源性（骆驼科动物衍生的配体），并且只限于某些AAV血清型（主要用于AAV2）。硫酸化纤维素，CellufineTM sulphated cellulose，是肝素树脂的替代材料，两者亲和性相似。

• AVB Sepharose High Performance是近年来亲和层析类的明星产品，可以纯化多种AAV血清型，AAV变种和人工合成的衣壳，具有强大的载体结合能力、可接受的浓度和较高回收率，已经在商业化生产中广泛使用。

  AVB与AAV的亲和力因血清型而异，例如AVB与AAV3的亲和力很强，但是与AAV8和AAV9的亲和力就很弱。差异的原因在于AAV的衣壳可变区是否存在一个序列为SPAKFA的AVB结合表位。研究人员将（与AVB结合力弱的）AAV8、rh.64R1, AAV9、 AAV-DJ或AAV-DJ/8等相应位置的序列替换为SPAKFA后，就极大地提高了这些血清型与AVB树脂的结合，而且不影响效力。

图四：AVB结合表位 “SPAKFA”

（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001.)

• 除了AVB亲和柱，POROS CaptureSelect Affinity 树脂也受到了越来越多的关注。这种树脂不仅具有强大的AAV颗粒结合能力(每毫升树脂结合约1014 vg)，还可以用于AAV8和AAV9的纯化，且回收率较高（AAV8～80%，AAV9～73%）。POROS树脂纯化效率很高，一次纯化即可有效地减少杂质；与AKTA设备相结合后可用于大规模AAV的纯化。

  有趣的是，POROS树脂并不像ABV树脂那样凭“特定的序列”与AAV结合，比如AAVrh8R 与AAV9更相似，但是只能用POROS AAV8树脂纯化；而AAV-DJ与AAV8在很大程度上是同源的，但AAV-DJ却不能用POROS AAV8树脂纯化。因此在使用POROS系统纯化某一特定AAV时，必须进行测试。

  POROS™ CaptureSelect™系统又开发出AAVX 亲和树脂。POROS AAVX可用于广泛的血清型，包括 AAV1-8、AAVrh10以及其他一些合成的血清型。

离子交换层析 (IEC) 是一种简单、通用且经济高效的技术，已成为许多载体纯化的关键步骤。IEC分为阴离子/阳离子交换柱，其中AEC（Anion-exchange chromatography）适用于AAV纯化，是大规模AAV生产中去除空衣壳的主要手段。

AAV衣壳亚种之间因表面电荷的差异导致不同的的等电点。空衣壳PI在6.3左右，包装了完整基因组DNA后的病毒颗粒PI大致为5.9。AAV与基质之间的静电相互作用正是取决于衣壳的等电点(pI)和缓冲液的pH值。基于这一原理在正电荷固定相上进行样品的分离纯化，去除杂质（如空衣壳和部分衣壳），并有效地回收目的载体。

尽管AEC理论上可以用于所有AAV血清型中的空衣壳的分离去除，但事实上，还是要就不同的血清型对树脂以及纯化条件进行优化。另外任何影响载体电荷的因素，如血清型、载体设计或转基因插入的长度，都可能需要重新优化纯化条件。

毫无疑问，AAV生产下游纯化至关重要，但如果在下游纯化阶段盲目追求高纯度，往往会造成产量的损失。宜明生物董事长兼首席技术官孙秀莲博士解释道：“下游纯化环节并非孤立存在，上游生产细胞系的选择、生产流程的设计、生物反应器性能与操作、生产原料的选择与把控，都很大程度影响下游纯化的效率。我们需要在产量与质量的矛盾中找到解决方案。”

图五：宜明生物的生物反应器（部分）左上：WAVE25/50，右上：200L一次性生物反应器细胞培养；左下，500L一次性生物反应器细胞培养；右下：2000L一次性生物反应器细胞培养

以宜明生物Ubri-Advanced^TMGMP级别AAV生产平台为例：

图六： 载体以及转染体系优化前后AAV空壳率的比较（200 L）。图A和B：经第一步亲和层析捕获后，AAV空壳率由优化前的74%降至56%；图C和C：经第二步AEC纯化后，AAV实心率为：85%；空壳率为8%；部分衣壳为6%。（数据来源：宜明生物）

*：与宜明生物合作的四款获批NMPA IND的分别是天泽云泰的“VGR-R01”和“VGB-R04 ”、朗昇生物的“LX101”以及微知卓的生物人工肝产品——血浆生物净化柱，其中前三款是AAV基因药物。